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Mar 08, 2023

Knockdown des mechanosensitiven Adapters Hic

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7446 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Arthrose (OA) ist die häufigste Gelenkerkrankung, die mit einer Zerstörung des Gelenkknorpels einhergeht. Matrix-Metalloproteinase-13 (MMP-13) spielt eine wesentliche Rolle bei der OA-Pathogenese durch den Abbau von Kollagen II, einem Hauptbestandteil des Gelenkknorpels. Es wurde bereits berichtet, dass der durch Wasserstoffperoxid induzierbare Klon 5 (Hic-5; TGFB1I1), ein durch den transformierenden Wachstumsfaktor β induzierbarer Mechanosensor, die OA-Pathogenese fördert, indem er die MMP-13-Expression in osteoarthritischen Läsionen der Maus hochreguliert. In unserer aktuellen Studie zeigte die immunhistochemische Analyse, dass die Hic-5-Proteinexpression im menschlichen OA-Knorpel im Vergleich zu normalem Knorpel erhöht war. Funktionelle Experimente zeigten, dass die Hic-5- und MMP-13-Expression durch mechanischen Stress erhöht wurde und die durch mechanischen Stress induzierte MMP-13-Expression durch Hic-5-siRNA in menschlichen Chondrozyten unterdrückt wurde. Darüber hinaus verlagerte sich die intrazelluläre Lokalisierung von Hic-5 von fokalen Adhäsionen in menschlichen Chondrozyten, die mechanischer Belastung ausgesetzt waren, in den Zellkern, und nukleares Hic-5 erhöhte die MMP-13-Genexpression. In vivo verringerte die intraartikuläre Injektion von Hic-5-siRNA den Score der Osteoarthritis Research Society International und die MMP-13-Proteinexpression im Gelenkknorpel von OA-Ratten. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Hic-5 die Transkription von MMP-13 in menschlichen Chondrozyten reguliert und dass Hic-5 ein neues therapeutisches Ziel für Arthrose sein könnte, da das Fortschreiten der Arthrose durch intraartikuläre Injektion von Hic-5-siRNA bei Ratten unterdrückt wurde.

Arthrose (OA) ist die häufigste Gelenkerkrankung, die durch einen Abbau des Gelenkknorpels gekennzeichnet ist. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass mehrere Risikofaktoren zur Entstehung von Arthrose beitragen, darunter Fettleibigkeit, genetische Veranlagung, Alterung, Trauma, Entzündung und übermäßiger mechanischer Stress1,2,3,4. Frühere In-vitro-Experimente mit Zellstrecksystemen haben gezeigt, dass übermäßiger mechanischer Stress die Expression von Matrix-Metalloproteinase-13 (MMP-13) induziert, die durch den Abbau von Kollagen II, einem Hauptbestandteil des Gelenkknorpels, eine wesentliche Rolle bei der OA-Pathogenese spielt5,6, 7. MMP-13-Knockout schützt bei Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) vor Knorpelabbau durch chirurgische Induktion8. Umgekehrt zeigen transgene Mäuse mit konstitutiv aktivem MMP-13, das spezifisch im Knorpel exprimiert wird, eine Gelenkknorpelerosion ähnlich wie bei menschlichem OA9.

Der durch Wasserstoffperoxid induzierbare Klon 5 (Hic-5) ist ein Gerüstprotein, das als durch Wasserstoffperoxid und den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β)10 induziertes Gen isoliert wird. Wir haben zuvor gezeigt, dass sich die subzelluläre Lokalisierung von Hic-5 als Reaktion auf mechanischen Stress von fokalen Adhäsionen zu Stress-Aktinfasern verschiebt und Hic-5 die Kontraktionsfähigkeit der Zelle steuert11. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Hic-5 an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen beteiligt ist. Unsere vorherige Studie zeigte, dass Hic-5 das aktivierte MMP-2 erhöht, indem es die Expression von Membran-Typ-1-MMP reguliert, was zur Bildung von Bauchaortenaneurysmen und Rupturen führt12. Bei Brusttumoren ist Hic-5 für die Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) und die Zellkontraktilität erforderlich, und bei Mäusen mit Hic-5-Mangel nimmt die Metastasierung in die Lunge ab13. Obwohl es Unterschiede in den detaillierten Mechanismen der Hic-5-Beteiligung an diesen Erkrankungen gibt, ist die Umgestaltung der ECM ein häufiger Mechanismus.

Kürzlich haben wir herausgefunden, dass die Hic-5-Expression im Gelenkknorpel von Mäusen während der frühen OA-Entwicklung zunimmt und dass Mäuse, denen Hic-5 fehlt, deutlich weniger Knorpelerosion aufweisen als WT-Mäuse14. In-vitro-Experimente mit murinen Chondrozyten zeigten auch, dass ein Hic-5-Mangel die durch übermäßige mechanische Belastung induzierte MMP-13-Expression verringert. Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob Hic-5 an der MMP-13-Expression beteiligt ist, die durch übermäßigen mechanischen Stress in menschlichen Chondrozyten induziert wird, und die Wirksamkeit von Hic-5 als therapeutisches Ziel für OA in vivo zu untersuchen.

Um die Rolle von Hic-5 bei der Pathogenese menschlicher Arthrose zu untersuchen, untersuchten wir zunächst die Hic-5-Expression im menschlichen Arthroseknorpel. Die Immunhistochemie zeigte, dass die Hic-5-Expression im OA-Knorpel höher war als im normalen Knorpel (Abb. 1A, B) und die Anzahl der Hic-5-positiven Zellen im OA-Knorpel signifikant erhöht war (Abb. 1C). Diese Ergebnisse stimmten mit unserem vorherigen Bericht überein, der darauf hinwies, dass Hic-5 im Knorpel von Mäusen mit chirurgisch induzierter OA14 stark exprimiert wurde.

Induktion der Wasserstoffperoxid-induzierbaren Klon-5-Expression (Hic-5) im menschlichen Osteoarthritis-Knorpel (OA). (A,B) Repräsentative immunhistochemische Färbung von Hic-5 in normalem und OA-Knorpel. Gestrichelte Linien zeigen die Oberfläche des Gelenkknorpels. Originalvergrößerung × 100 Zoll (A); × 400 Zoll (B). Balken = 100 μm. (C) Quantifizierung von Hic-5-positiven Zellen in normalem (n = 3) und OA-Knorpel (n = 3). Die Daten wurden mit dem ungepaarten t-Test analysiert. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. **P < 0,01.

In der vorherigen Studie haben wir gezeigt, dass die Hic-5- und MMP-13-Expression in artikulären Chondrozyten der Maus durch übermäßige mechanische Belastung erhöht wurde14. Daher untersuchten wir, ob menschliche Gelenkchondrozyten zusätzlich zu anderen MMPs und dem Gewebeinhibitor der Matrix-Metalloproteinase-1 (TIMP-1) auch eine durch mechanische Belastung induzierte erhöhte Expression von Hic-5 und MMP-13 aufwiesen. Infolgedessen waren die Hic-5-, MMP-3- und MMP-13-mRNA-Spiegel in menschlichen Chondrozyten, die durch mechanische Belastung stimuliert wurden, im Vergleich zu unstimulierten Chondrozyten erhöht (Abb. 2A). Die MMP-1-Expression neigte dazu, durch mechanischen Stress hochreguliert zu werden, der Unterschied war jedoch nicht signifikant und es gab keinen Einfluss von mechanischem Stress auf die MMP-2- oder TIMP-1-Expression. Als nächstes untersuchten wir die Auswirkung des Hic-5-Knockdowns auf die MMP-Genexpression unter Verwendung von Hic-5 Small Interfering RNA (siRNA) und Kontroll-siRNA als Negativkontrolle. Obwohl der Hic-5-Knockdown durch siRNA die MMP-13-Expression ohne mechanischen Stress nicht veränderte, wurde die durch mechanischen Stress induzierte MMP-13-Expression durch Hic-5-siRNA im Vergleich zur Kontroll-siRNA signifikant reduziert. Hic-5-siRNA hatte jedoch keinen Einfluss auf die MMP-1- oder MMP-3-Expression (Abb. 2B). Diese Ergebnisse ähnelten unseren früheren Ergebnissen, die bei aus Hic-5-Knockout-Mäusen isolierten Chondrozyten beobachtet wurden, was darauf hinweist, dass Hic-5 die MMP-13-Genexpression neben anderen MMPs unter mechanischer Belastung spezifisch reguliert.

Abschwächung der durch mechanischen Stress induzierten Expression der Matrix-Metalloproteinase (MMP-13) durch Hic-5-Knockdown in menschlichen Chondrozyten. (A) mRNA-Spiegel von Hic-5, MMPs und Gewebeinhibitor der Matrix-Metalloproteinase-1 (TIMP-1) in menschlichen Chondrozyten, die 30 Minuten lang mechanischem Stress (MS+) ausgesetzt oder unbehandelt (MS−) waren. Die Zellen wurden 1 Stunde nach der mechanischen Belastung gesammelt. (n = 8 biologische Replikate). (B) Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf den Hic-5-Knockdown in menschlichen Chondrozyten mit oder ohne mechanische Belastung. Menschliche Chondrozyten wurden 24 Stunden lang mit Hic-5-siRNA (10 nM) oder Kontroll-siRNA (10 nM) behandelt, bevor sie durch mechanische Belastung stimuliert wurden. (n = 4 biologische Replikate). Die relativen mRNA-Spiegel wurden durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. *P < 0,05; **P < 0,01; §P = 0,0572 durch den ungepaarten t-Test in (A) oder einseitige Varianzanalyse mit Tukey-Test für mehrere Vergleiche in (B).

Als nächstes beobachteten wir die intrazelluläre Lokalisierung von Hic-5 in menschlichen Chondrozyten mit oder ohne mechanische Belastung. Hic-5 wurde an fokalen Adhäsionen unter unstimulierten Bedingungen nachgewiesen, wohingegen die Hic-5-Expression in fokalen Adhäsionen nach 0,5 Hz und 10 % zyklischer Zugbelastung für 30 Minuten abgeschwächt wurde (Abb. 3A). Darüber hinaus war die Hic-5-Färbung im Kern nach 3-stündiger zyklischer Zugbelastung deutlich ausgeprägt (Abb. 3A). Hic-5 pendelt normalerweise über ein nukleares Exportsignal (NES)15 zwischen fokalen Adhäsionen und dem Zellkern. Unter Berücksichtigung der Möglichkeit, dass mechanischer Stress die Shuttle-Geschwindigkeit beschleunigt, untersuchten wir Veränderungen in der subzellulären Lokalisierung von Hic-5 nach zyklischer Zugbelastung unter Behandlung mit Leptomycin B (LMB), einem NES-Inhibitor. Die Signalintensität im Zellkern wurde durch LMB 1 Stunde nach der Behandlung leicht erhöht, wohingegen die Zugabe sowohl von mechanischem Stress für 1 Stunde als auch von LMB eindeutig die Kernlokalisierung von Hic-5 in menschlichen Chondrozyten induzierte (Abb. 3B). Unsere vorherige Studie berichtete, dass im Kern angesammeltes Hic-5 als Reaktion auf H2O2 an der Transkriptionskontrolle von c-fos15 beteiligt ist. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die durch mechanische Kraft verursachte Translokation von Hic-5 von fokalen Adhäsionen zum Zellkern die MMP-13-Expression reguliert.

Subzelluläre Lokalisierung von Hic-5 in menschlichen Chondrozyten, stimuliert durch mechanischen Stress. (A) Intrazelluläre Lokalisierung von Hic-5 in menschlichen Chondrozyten, die 30 Minuten oder 3 Stunden lang mechanischem Stress ausgesetzt waren (MS+) oder unbehandelt waren (MS−). Pfeilspitzen weisen auf fokale Verwachsungen hin. (B) Immunfluoreszenzbildgebung von nuklearem Hic-5 in menschlichen Chondrozyten nach mechanischer Belastung. Menschliche Chondrozyten wurden 1 Stunde lang 10 ng/ml Leptomycin B (LMB) und mechanischem Stress ausgesetzt. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Das repräsentative Bild wurde aus drei biologischen Replikaten ausgewählt. Originalvergrößerung: × 400. Balken = 50 μm.

Um festzustellen, ob die MMP-13-Expression durch im Zellkern lokalisiertes Hic-5 in menschlichen Chondrozyten induziert wurde, exprimierten wir Hic-5 im Zellkern unter Verwendung eines mit dem Kernlokalisierungssignal (NLS) konjugierten Hic-5-Expressionsvektors (NLS-HA-hic). -5). NLS-HA-Hic-5 erhöhte dosisabhängig den mRNA-Spiegel von MMP-13 in menschlichen Chondrozyten (Abb. 4A). In ähnlicher Weise zeigten die Western-Blot-Analyse und die doppelte Immunfluoreszenzfärbung von Hic-5 und MMP-13, dass das MMP-13-Protein in NLS-HA-hic-5-exprimierenden Chondrozyten im Vergleich zu nicht transfizierten Chondrozyten erhöht war (Abb. 4B, C).

Hochregulierung der MMP-13-Expression durch nukleares Hic-5 in menschlichen Chondrozyten. (A) Induktion von MMP-13 in menschlichen Chondrozyten, die exogen Hic-5 exprimieren, das mit einem Kernlokalisierungssignal (NLS-HA-Hic-5) markiert ist. Menschliche Chondrozyten wurden 24 Stunden lang mit dem NLS-HA-Hic-5-Expressionsvektor in den in der Grafik gezeigten Konzentrationen transfiziert. Die Hic-5- und MMP-13-Expression wurde durch quantitative Polymerasekettenreaktion gemessen (n = 3 biologische Replikate). (B) Western Blot von MMP-13 in menschlichen Chondrozyten, transfiziert mit oder ohne 0,2 µg NLS-Hic-5 (n = 3 biologische Replikate). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. **P < 0,01 durch den Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest in (A) oder dem ungepaarten t-Test in (B). Western-Blot-Bilder wurden zugeschnitten und Blots in voller Länge sind in der ergänzenden Abbildung 1 enthalten. (C) Doppelte Immunfluoreszenzfärbung von Hic-5 (grün) und MMP-13 (rot) in menschlichen Chondrozyten, die mit oder ohne NLS-HA transfiziert wurden. Hic-5. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Das repräsentative Bild wurde aus drei biologischen Replikaten ausgewählt. Originalvergrößerung: × 400. Balken = 50 μm.

Wir haben das therapeutische Potenzial von Hic-5 bei der OA-Entwicklung anhand eines chirurgischen Rattenmodells für OA bewertet. Zuerst haben wir Ratten-Hic-5-siRNA entworfen und die Wirkung sowohl in JTC-19- als auch in RAT-2-Rattenzelllinien validiert. Die Hic-5-Expression war in Hic-5-siRNA-exprimierenden Zellen im Vergleich zur Kontrolle deutlich unterdrückt (Abb. 5A). Als nächstes wurde alle 3 Tage vom 10. bis 19. Tag nach der medialen Meniskektomie (MMx) Hic-5-siRNA in die intraartikulären Räume der Kniegelenke der Ratte injiziert (Abb. 5B).

In-vivo-Effekt des Hic-5-Knockdowns auf Arthrose im Modell der medialen Meniskektomie (MMx) der Ratte. (A) mRNA-Spiegel von Hic-5 in Rattenzelllinien, die mit Hic-5-siRNA transfiziert wurden (n = 5 biologische Replikate). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. **P < 0,01, durch einseitige Varianzanalyse mit Tukey-Test für mehrere Vergleiche. (B) Zeitplan für den chirurgischen Eingriff zur OA-Induktion und -Behandlung durch intraartikuläre Injektion von siRNA. 10 Tage nach der Operation wurden die Ratten getötet, um die OA-Induktion zu überprüfen (Tag 10) (n = 3). Hic-5-siRNA (n = 8) oder nukleasefreies Wasser als Vehikel (n = 8) wurden 10, 13 und 16 Tage nach der Operation (insgesamt 3 Injektionen) in die intraartikulären Räume der Kniegelenke verabreicht und unbehandelt Ratten waren die Kontrolle (n = 3). (C) Repräsentative Safranin-O-Färbung des Schienbeinknorpels bei Ratten, die MMx ausgesetzt waren. Die rechten Felder zeigen Ansichten der umrahmten Bereiche in den linken Feldern in stärkerer Vergrößerung. Originalvergrößerung × 40 in den linken Feldern, Balken = 500 µm; × 100 in rechten Feldern, Balken = 200 μm. (D) OA Research Society International (OARSI)-Score des Knorpelabbaus in den angegebenen Gruppen. Linien stellen den Median dar. *P < 0,05, durch den Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest.

Die histologische Analyse zeigte, dass die Bildung von OA-Läsionen bereits 10 Tage nach der Operation aufgetreten war. Am 19. Tag, also 9 Tage nach Beginn der siRNA-Injektion, zeigte die siRNA-injizierte Rattengruppe eine gehemmte OA-Progression und niedrigere Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-Werte als die Vehikelgruppe (Abb. 5C, D und Ergänzungstabelle 2). . Darüber hinaus bestätigte die Immunhistochemie eine Abnahme der Hic-5- und MMP-13-Expression im Knieknorpel in der siRNA-injizierten Gruppe im Vergleich zu Gruppen ohne siRNA-Injektion, einschließlich Tag 10-, unbehandelter und Vehikel-Gruppen (Abb. 6A–D). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Hic-5, das durch übermäßigen mechanischen Stress induziert wird, die OA-Entwicklung durch eine Erhöhung der MMP-13-Transkription steigert (Abb. 6E).

In-vivo-Unterdrückung der MMx-induzierten Proteinexpression von Hic-5 und MMP-13 durch intraartikuläre Injektion von Hic-5-siRNA in Ratten. (A,B) Repräsentative Immunfluoreszenz von Hic-5 (A, grün) und MMP-13 (B, grün) in MMx-operiertem Tibiaknorpel mit intraartikulärer Injektion von Hic-5-siRNA (n = 8) oder Vehikel (n = 8) oder MMx-operierter Tibiaknorpel ohne Behandlung (Tag 10, n = 3 und unbehandelt 19 Tage nach MMx, n = 3). Zur Zählung der gesamten Zellen wurde Phalloidin (rot) verwendet. Originalvergrößerung × 200, Balken = 100 µm. (C,D) Raten von Hic-5-positiven Zellen (C) und MMP-13-positiven Zellen (D) im Schienbeinknorpel von Ratten. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. *P < 0,05; **P < 0,01, durch einseitige Varianzanalyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. (E) Schematisches Modell, das zeigt, dass übermäßiger mechanischer Stress die MMP-13-Expression durch Hic-5 induziert, was zur OA-Entwicklung führt.

Die aktuelle Studie charakterisiert Hic-5 als einen wichtigen Regulator der OA-Entwicklung, indem es den Knorpelabbau fördert. Es gab einen signifikanten Anstieg der Hic-5-Expression im menschlichen OA-Knorpel, nicht jedoch im Nicht-OA-Knorpel. In-vitro-Experimente zeigten, dass übermäßiger mechanischer Stress die Hic-5- und MMP-13-Expression in menschlichen Chondrozyten induzierte und der Hic-5-Knockdown die erhöhte Expression von MMP-13 unterdrückte, dem wichtigsten ECM-abbauenden Enzym bei der OA-Bildung. Darüber hinaus veränderte übermäßiger mechanischer Stress die subzelluläre Lokalisierung von Hic-5 durch fokale Adhäsionen am Zellkern, und die nukleare Akkumulation von Hic-5 führte zur Transkriptionsregulation von MMP-13. In-vivo-Experimente zeigten, dass die intraartikuläre Verabreichung von Hic-5-siRNA die MMP-13-Expression herunterregulierte und eine schützende Wirkung gegen Knorpelabbau bei OA-Modellratten hatte. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Hic-5 ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für Arthrose sein könnte.

Hic-5 ist an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen wie Leberfibrose, Pankreasfibrose und Darmkrebs beteiligt, da es als Gerüst für mehrere Zellsignale und als Regulator der ECM-bezogenen Genexpression fungiert16,17,18. Wir haben zuvor berichtet, dass die Hic-5-Expression bei Patienten mit diesen Störungen höher war als bei gesunden Kontrollpersonen. Bei Leber- und Pankreasfibrose fungiert Hic-5 als Gerüst für den TGF-β/Smad2-Weg und sein Mangel schwächt die Leber- und Pankreasfibrose von Mäusen durch eine Verringerung der Kollagenproduktion, die die wichtigste ECM-Komponente bei Fibrose darstellt, erheblich ab16,17. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Überexpression von Hic-5 mithilfe eines Adenovirus-Vektors in menschlichen normalen Fibroblasten die Expression von Lysyloxidase (LOX) erhöht, was die ECM-Steifheit erhöht und das Fortschreiten des Tumors fördert18. Noch interessanter ist, dass die Azoxymethan-induzierte kolorektale Tumorinzidenz bei Mäusen mit Hic-5-Mangel im Vergleich zu WT-Mäusen unterdrückt wurde. In dieser Studie fanden wir in ähnlicher Weise heraus, dass Hic-5 die Auflösung von ECM-reichem Knorpel als Regulator von MMP-13 regulierte und dass der Abbau von Hic-5 durch siRNA bei Ratten zu einer Abschwächung der chirurgisch induzierten Arthrose führte. Darüber hinaus war die Hic-5-Expression im menschlichen OA-Knorpel erhöht. Zusammengenommen könnte Hic-5 eine Rolle als ECM-Regulator im Prozess der menschlichen Arthrose spielen.

Diese Studie ergab die neuartige Erkenntnis, dass mechanischer Stress die Hic-5-Genexpression und -Translokation in menschlichen Chondrozyten induziert. Hic-5 befindet sich überwiegend in fokalen Adhäsionen und wird im Zellkern unter Stimulation durch ROS in normalen menschlichen Fibroblasten und durch TGF-β in normalen menschlichen dermalen Fibroblasten ohne mechanische Belastung gefunden15,19. Wir haben jedoch zuvor gezeigt, dass Hic-5 nach mechanischer Belastung in embryonalen Fibroblasten von Mäusen von fokalen Adhäsionen zu Aktinfasern verlagert wird11. Diese Ergebnisse und die vorliegenden Daten unterscheiden sich hinsichtlich der Hic-5-Translokation, was möglicherweise auf die unterschiedlichen mechanischen Stressbedingungen und die unterschiedlichen Zelltypen zurückzuführen ist, die in der Analyse verwendet wurden.

Bei Darmkrebs induziert im Zellkern angesammeltes Hic-5 die Expression von LOX, das die Vernetzung von Kollagenfasern katalysiert, um die ECM-Steifheit zu erhöhen18. Darüber hinaus wandert Hic-5 nach mechanischer Belastung in den Zellkern und ist an der Genexpression von Matrix-abbauenden Enzymen in Chondrozyten beteiligt. Die Stimulation fokaler Adhäsionsplaques durch erhöhte ECM-Steifheit steht im Einklang mit einem mechanischen Belastungszustand. Zusammengenommen spielt Hic-5 wahrscheinlich eine wechselseitige Rolle bei der Regulierung der Mikroumgebungssteifigkeit der ECM, indem es eine Zunahme der ECM-Steifheit wahrnimmt, was zu einer nuklearen Translokation und Induktion der Genexpression im Zusammenhang mit der Kontrolle der ECM-Steifigkeit führt. Obwohl die Hic-5-Genexpression durch mechanischen Stress leicht erhöht wurde, wurde die MMP-13-Expression in menschlichen Chondrozyten deutlich unterdrückt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die nukleare Translokation von Hic-5 und nicht die durch mechanischen Stress induzierte Erhöhung seiner Expression für die OA-Entwicklung wichtig ist.

Wir haben zuvor berichtet, dass Hic-5 die c-fos-Genexpression über AP-1-, Ets- und Sp1-Bindungsstellen reguliert20. Darüber hinaus ist bekannt, dass die meisten Mitglieder der MMP-Familie AP-1-Bindungsstellen in ihren Promotorregionen haben und ein selektiver c-Fos/AP-1-Inhibitor die MMP-13-Expression in menschlichen Chondrozyten unterdrückt. Darüber hinaus unterdrückt die intraartikuläre Verabreichung des Inhibitors die MMP-13-Expression in einem Maus-OA-Modell21. Daher kann Hic-5 die MMP-13-Transkription durch Interaktion mit AP-1 fördern.

Kürzlich wurden verschiedene Studien an tierischen OA-Modellen durchgeführt, die durch intraartikuläre Injektion niedermolekularer Arzneimittel behandelt wurden, um das Potenzial neuartiger therapeutischer Arzneimittel zu untersuchen. Beispielsweise verhindert die intraartikuläre Injektion von Dexamethason, Rebamipid oder Statinen das Fortschreiten der Arthrose in Tiermodellen durch Herunterregulieren der MMP-13-Expression22,23,24,25,26,27. Hic-5 wurde herkömmlicherweise als schwierig durch niedermolekulare Medikamente zu hemmen angesehen, da es ein intrazelluläres Adapterprotein ist und keine enzymatische Aktivität aufweist. Die Hemmung von Hic-5 in vivo wurde jedoch kürzlich durch Nukleinsäuretherapeutika ermöglicht, ein neues Werkzeug, das einen selektiven Gen-Knockdown über Plasmamembranen hinweg ermöglicht. In der vorliegenden Studie unterdrückte die intraartikuläre Injektion von Hic-5-siRNA das Fortschreiten der Arthrose bei Ratten. Somit haben wir nicht nur Hic-5 als therapeutisches Ziel für Arthrose identifiziert, sondern auch festgestellt, dass Hic-5-siRNA ein neuartiges therapeutisches Medikament für Arthrose sein könnte.

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass Hic-5 als Transkriptionsmediator von MMP-13 den Knorpelabbau reguliert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Hic-5-siRNA eine potenzielle therapeutische Anwendung hat, die bei OA klinisch nützlich sein könnte.

Formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte aus menschlichem Gelenkknorpel wurden von ORIGENE (MD, USA) bezogen. Normale Gelenkknorpel stammten von 3 Männern im Alter von 36, 52 und 57 Jahren. 3 OA-Knorpel stammten von 2 Männern im Alter von 73 und 76 Jahren und einer Frau im Alter von 87 Jahren. Schienbeinknorpel von Ratten wurde in 10 % gepuffertem Formalin fixiert, in Ameisensäure entkalkt und eingebettet in Paraffin einlegen und in 4 µm dicke Abschnitte schneiden.

Für die Immunhistochemie wurden Signale mit dem CSAII Biotin-free Tyramide Signal Amplification System (Aglient Technologies, CA, USA) erfasst. Die Schnitte wurden mit einem primären Anti-Hic-5-Antikörper (1:100; 611165, BD Biosciences, NJ, USA) und einem Anti-MMP-13-Antikörper (1:150; ab39012, Abcam, Cambridge, UK) inkubiert und mit gegengefärbt DAPI oder Phalloidin. Die Anzahl der Hic-5- und MMP-13-positiven Zellen wurde durch Zählen immunpositiver Zellen in Sagittalschnitten des Kniegelenks bei 200-facher Vergrößerung quantifiziert. Der Prozentsatz positiver Zellen wurde mit der BZ-II-Analysator-Software (Keyence, Osaka, Japan) bestimmt.

Für die Immunzytochemie wurden kultivierte Chondrozyten in 3,7 % gepuffertem Formalin fixiert und mit 3 % Rinderserumalbumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1 % Tween-20 blockiert. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem Primärantikörper angefärbt und dann mit Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern (Invitrogen, MA, USA) inkubiert.

Normale menschliche Gelenkchondrozyten von einem 26-jährigen und einem 47-jährigen Mann wurden von Lonza gekauft und in Chondrozyten-Basalmedium (Lonza, Basel, Schweiz) gemäß den Anweisungen des Herstellers kultiviert. Für Experimente wurden menschliche Chondrozyten der Passage 3–6 verwendet.

Menschliche Chondrozyten wurden auf eine mit Fibronektin beschichtete Silikonkammer (354008; Corning, NY, USA) mit 4 × 104 Zellen/Kammer ausplattiert. Jede Kammer hatte eine Kulturoberfläche von 2 × 2 cm. Eine zyklische Zugspannung (0,5 Hz, 10 % Dehnung) wurde unter Verwendung des uniaxialen Strecksystems NS-550 (STREX, Osaka, Japan) in einem CO2-Inkubator ausgeübt.

Auf Siliziumkammern kultivierte menschliche Chondrozyten wurden 4 Stunden lang mit Hic-5-siRNA (vorwärts: 5ʹ-GGACCAGUCUGAAGAUAAG-3ʹ; rückwärts: 5ʹ-CUUAUCUUCAGACUGGUCC-3ʹ, 10 nmol/l) oder Kontroll-siRNA (10 nmol/l; Ambion, TX) transfiziert , USA) unter Verwendung von Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen, MA, USA). Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 20 Stunden bei 37 °C kultiviert. Anschließend wurden die Zellen einer zyklischen Zugbelastung ausgesetzt. Um ein Fusionsprotein zu exprimieren, das ein Kernlokalisierungssignal (NLS) am N-Terminus von hic-5 trägt, wurde ein zuvor beschriebener NLS-hic-5-Expressionsvektor (NLS-HA-hic-5)20 mit Lipofectamin transfiziert 3000 (Invitrogen, MA, USA).

Die vollständige RNA-Extraktion und die reverse Transkription wurden mit einem SuperPrep II Cell Lysis RT Kit für qPCR (TOYOBO, Osaka, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Um die mRNA-Expression von Hic-5, MMP-13, MMP-1, MMP-2, MMP-3 und TIMP-1 zu quantifizieren, wurde eine Echtzeit-qPCR-Analyse mit KOD SYBR q PCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan) durchgeführt. . Die Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Zielgenexpression wurde unter Verwendung der 2−ΔΔCt-Methode auf GAPDH normalisiert.

Proteine ​​wurden aus menschlichen Chondrozyten unter Verwendung einer Lyselösung, die 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, extrahiert. Die Proteine ​​wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert, auf eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen und unter Verwendung von Anti-MMP-13 (1:1000; Abcam, Cambridge, UK), Anti-HA (1:1000; Proteintech, IL, USA) nachgewiesen ) und Anti-GAPDH-Antikörper (1:5000; MBL, Tokio, Japan). Die Bandendichten wurden mit der Densitograph-Software (ATTO, Tokio, Japan) quantifiziert.

Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der UNITECH Co. Ltd. genehmigt und bei UNITECH gemäß den ethischen Richtlinien durchgeführt. Alle Methoden wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) gemeldet. Sieben Wochen alte männliche Slc:Wistar-Ratten wurden vor der Operation eine Woche lang unter einem 12-stündigen Lichtzyklus in einem klimatisierten Raum gehalten. Experimentelle OA wurde durch MMx28 induziert. Kurz gesagt wurde bei Ratten eine Anästhesie eingeleitet [Medetomidin (2 mg/kg Körpergewicht), Midazolam (0,4 mg/kg), Butorphanol (5 mg/kg)]. Die Knie und die umliegenden Bereiche wurden rasiert. An der Vorderseite des rechten Knies wurde ein Längsschnitt vorgenommen. Anschließend durchtrennten wir das mediale Seitenband und das vordere Kreuzband des rechten Knies. Als nächstes wurde der Innenmeniskus entfernt. Die Kniekapsel und das Unterhautgewebe wurden genäht und die Haut verschlossen. Die intraartikuläre Behandlung wurde 10 Tage nach der Operation begonnen. Entweder Hic-5-siRNA (vorwärts: 5′-GGAUCAUCUAUACAGCACA-3′; rückwärts: 5′-UGUGCUGUAUAGAUGAUCC-3′, 10 nmol/L) (n = 8) oder nukleasefreies Wasser (n = 8) als Vehikel mit AteloGene Local Verwendung: Quick Gelation (Koken, Tokio, Japan) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers in die intraartikulären Räume von Rattenkniegelenken injiziert. Der Schweregrad der Arthrose wurde mithilfe des OARSI-Bewertungssystems von UNITECH Co. Ltd. quantifiziert29,30.

Die Datennormalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Normalitätstest bewertet. Wenn die Verteilung normal war, wurde der ungepaarte t-Test verwendet, um zwei Gruppen von Proben zu vergleichen, und eine einseitige Varianzanalyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest wurde verwendet, um Daten von mehr als drei Gruppen zu vergleichen. Der Kruskal-Wallis-Test gefolgt vom Dunn-Test wurde verwendet, um nichtparametrische Daten aus mehreren Gruppen zu vergleichen. Alle Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angegeben. P-Werte von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten. Rückfragen können an den entsprechenden Autor gerichtet werden.

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Wir danken Mitchell Arico und RJ Frampton von der Edanz Group (http://www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Diese Arbeit wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI Grant 17K10713 an XF L. und 21K16098 an Ay. M.) und AMED unter der Grant-Nummer JP22fk0210089 unterstützt.

Abteilung für Biochemie, Showa University School of Medicine, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawa-ku, Tokio, 142-8555, Japan

Aya Miyauchi, Masahito Noguchi, Xiao-Feng Lei, Momoko Kobayashi-Tanabe, Shogo Haraguchi, Akira Miyazaki und Joo-ri Kim-Kaneyama

Medizinische Abteilung, Abteilung für Gastroenterologie, Showa University School of Medicine, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawa-ku, Tokio, 142-8666, Japan

Masashi Sakaki

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Konzeption und Design der Studie: JKK und XFL Datenerfassung: Ay.M., MN und MKT Analyse und Interpretation der Daten: MS, SH und AM Verfassen des Manuskripts: Ay.M. und JKK Genehmigte endgültige Version des Manuskripts: alle Autoren.

Korrespondenz mit Joo-ri Kim-Kaneyama.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Miyauchi, A., Noguchi, M., Lei, XF. et al. Der Abbau des mechanosensitiven Adapters Hic-5 lindert posttraumatische Osteoarthritis bei Ratten durch Unterdrückung von MMP-13. Sci Rep 13, 7446 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34659-x

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Eingegangen: 18. Februar 2023

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34659-x

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